枸杞籽油激活SIRT3改善亚急性衰老大鼠睾丸及支持细胞氧化应激的研究
摘要：目的本研究旨在研究枸杞籽油对睾丸抗氧化应激的影响,通过探索枸杞籽油在衰老大鼠睾丸中的抗氧化作用,阐明枸杞籽油激活SIRT3提高了支持细胞（TM4）在D-半乳糖刺激中的耐受性,深入探讨枸杞籽油的抗氧化作用,以期为保护睾丸抗衰老、提高睾丸功能提供新的途径。方法体内实验:60只8周龄雄性SD大鼠随机分为6组,分别为空白对照组、衰老模型组、极低剂量组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。除空白对照组外,其余组大鼠建立亚急性衰老模型,给予D-半乳糖皮下注射125 mg/kg/d,持续8周,而空白对照组同等量的生理盐水皮下注射。在皮下注射4周时,极低剂量组给予枸杞籽油500 mg/kg/d灌胃、低剂量组给予枸杞籽油1000 mg/kg/d灌胃、中剂量组给予枸杞籽油1500 mg/kg/d灌胃、高剂量组给予2000 mg/kg/d灌胃4周,空白对照组和衰老模型组给予同等量生理盐水灌胃4周,同时继续给予皮下注射直至8周。通过观察睾丸组织形态学改变以及半乳糖苷酶免疫组化结果和衰老相关蛋白（p16INK4A、P21Waf1/Cip1、γH2A.X蛋白以及半乳糖苷酶）检测,评估亚急性衰老模型的建立。血清中相关氧化因子超氧化物歧化酶（S O D）、谷胱甘肽（GSH）、活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）以及8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）;睾丸NRF2、SIRT3、HO-1、SOD-1和SOD-2的蛋白表达水平被检测。观察睾丸形态学,Johnsen评分评估睾丸的生精功能以及血清睾酮和血清抑制B（INHB）水平检测睾丸分泌功能,免疫荧光共定位观察SIRT3在睾丸支持细胞中的定位表达。体外实验:不同D-半乳糖浓度干预小鼠支持细胞（TM4细胞）建立TM4细胞衰老模型,将细胞分为5组,分别加入完全培养基或4种不同浓度的D-半乳糖 50 mmol/L、100 mmol/L、150 mmol/L、200 mmol/L 进行干预 3 个时间段分别为24h、36h以及48h。通过CCK-8检测细胞抑制率,半乳糖苷酶染色和相关衰老蛋白表达水平检测,筛选出最佳D-半乳糖干预的浓度与时间。在此基础上,分别设立5个组包括衰老模型组和4组不同浓度枸杞籽油实验组（25μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL）,除衰老模型组外,不同枸杞籽油提前干预6h,加入200 mmol/L D-半乳糖48h进行干预。CCK-8检测各组细胞活性;NRF2、SIRT3、HO-1、SOD-1和SOD-2的蛋白表达水平被检测。为探讨枸杞籽油抗氧化作用机制,慢病毒沉默SIRT3,设置4个组:衰老组、枸杞籽油组、SIRT3沉默组（si-SIRT3）和si-SIRT3+枸杞籽油组。枸杞籽油组100 μg/mL枸杞籽油提前6h干预后加入D-半乳糖干预66h;si-SIRT3组中si-SIRT3慢病毒提前转染TM4细胞6h后加入D-半乳糖干预66h;si-SIRT3+枸杞籽油组:枸杞籽油和si-SIRT3慢病毒提前6h干预TM4细胞后加入D-半乳糖干预66h;衰老组TM4细胞与其他实验同一时间加入D-半乳糖干预相同时间。NRF2、SIRT3、HO-1、SOD-1和SOD-2的蛋白表达水平被检测。另外慢病毒过表达SIRT3设置三个组:衰老组、枸杞籽油组和SIRT3过表达组（OE-SIRT3 组）。检测 TM4 细胞 SIRT3、p-AMPK、AMPK、p-PGC-1α 和 PGC-1α蛋白表达水平。结果1.亚急性衰老大鼠模型评价:与空白对照组相比,衰老模型大鼠血清抗氧化因子如SOD和GSH显著降低,ROS、MDA和8-OHdG氧化物质的产生显著增加,差异有统计学意义;相关衰老蛋白p16INK4A、P21Waf1/Cip1、γH2A.X蛋白以及半乳糖苷酶在衰老模型组的表达显著性上调,差异有统计学意义;与对照组相比,衰老模型组睾丸组织各级的支持细胞和生殖细胞数量明显减少,失去了从精原细胞到精子细胞的正常排列形态;β-半乳糖苷酶染色中,衰老睾丸组织明显高表达。2.枸杞籽油改善亚急性衰老大鼠睾丸氧化应激损伤:与衰老模型组比较,除极低组外,不同浓度枸杞籽油组的大鼠血清SOD和GSH抗氧化因子显著上升,ROS、MDA和8-OHdG等关键氧化因子显著下降,但是低中高剂量组之间没有统计学差异;同时三组低中高枸杞籽油组大鼠睾丸中HO-1、NRF2、SOD-1和SOD-2的表达明显上升,但是三组之间无统计学差异,不存在浓度梯度的依赖性。3.枸杞籽油激活大鼠睾丸SIRT3表达:衰老大鼠给予枸杞籽油灌胃后,大鼠睾丸SIRT3的mRNA和蛋白表达水平显著性上调,且SIRT3的表达主要集中在睾丸支持细胞。4.枸杞籽油改善大鼠睾丸功能:Johnsen评分评价睾丸组织生精功能。与衰老模型相比,枸杞籽油干预后,睾丸组织评分从7.69±0.24显著提高到8.85±0.19。与此同时,枸杞籽油组大鼠血清中支持细胞分泌的INHB和睾酮水平明显高于衰老模型组。5.TM4细胞衰老模型评估:与正常比较,D-半乳糖干预TM4细胞24h与36h,无论哪个浓度,抑制率都为负,其细胞活力反而呈增长趋势,但是当D-半乳糖浓度为200 mmol/L干预48h时,细胞增殖受到明显抑制,与干预前细胞比较,差异有统计学意义;不同浓度D-半乳糖干预48h,与空白对照比较,200 mmol/L浓度干预的细胞组半乳糖苷酶染色阳性细胞率显著性升高;相关衰老蛋白在衰老模型组的表达显著性上调。6.枸杞籽油对TM4衰老细胞抗氧化作用:100 μg/mL和150 μg/mL浓度枸杞籽油干预的TM4衰老细胞数和细胞活性明显上升且半乳糖苷酶染色阳性率也显著性下降;枸杞籽油干预后TM4细胞NRF2、SIRT3、HO-1、SOD-1、SOD-2表达都明显上调。7.枸杞籽油激活SIRT3保护TM4抗氧化作用:枸杞籽油干预后SIRT3的mRNA和蛋白水平上调;TM4细胞SIRT3沉默后,SIRT3、HO-1、SOD-1和SOD-2表达显著性下降;与衰老模型组比较,SIRT3 过表达组和枸杞籽油干预组的 SIRT3 表达,p-AMPK/AMPK和p-PGC-1α/PGC-1α表达都明显上调。结论1.在建立D-半乳糖诱导的亚急性衰老模型基础上,枸杞籽油通过激活大鼠睾丸组织SIRT3表达,保护大鼠睾丸抗氧化应,改善睾丸功能。2.以200 mmol/L半乳糖干预M4细胞48h成功建立衰老模型,在此基础上,枸杞籽油干预TM4衰老细胞,阐明枸杞籽油通过激活SIRT3保护TM4细胞的抗氧化作用。3.枸杞籽油激活SIRT3,通过AMPK/PGC-1α通路维持线粒体稳态并减轻TM4细胞氧化应激损伤。